兽药评审中心IVDC发布兽药重复给药毒性试验技术指导原则

兽药重复给药毒性试验技术指导原则

一、概述

（一）目的

重复给药毒性试验是描述动物重复接受受试物后的毒性特征，它是非临床安全性评价的重要内容。重复给药毒性试验可以：①预测受试物可能引起的靶动物临床不良反应，包括不良反应的性质、程度、量效关系、时效关系、可逆性等；②判断受试物重复给药的毒性靶器官或靶组织；③确定未观察到不良反应剂量（No Observed Adverse Effect Level，NOAEL），是制定日允许摄入量（Acceptable Daily Intake，ADI）和动物性食品最大残留限量（Maximum Residue Limit，MRL）的重要数据；④为临床试验不良反应监测及防治提供参考。

（二）适用范围

本指导原则适用于兽用化学药物、兽用中药和兽用天然药物。消毒剂参考使用。

二、基本原则

兽药重复给药毒性试验须遵守《兽药非临床研究质量管理规范》或《药物非临床研究质量管理规范》。

试验设计要结合受试物理化性质和作用特点，需关注与其他药理毒理试验设计和研究结果的关联性，关注同类药物靶动物临床使用情况及适应证等，重复给药毒性试验结果应与其他药理毒理试验研究互为说明、补充或/和印证。

三、基本内容

（一）受试物

化学药物：受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应注明受试物名称、来源、批号、生产日期、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格和生产单位等，并符合试验要求。

中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、生产日期、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格及生产单位。

在药物研发的过程中，若受试物的工艺发生变化可能影响其安全性的，应进行相应的安全性研究。

化学药物试验过程中应进行受试物样品分析，并提供样品分析报告。成分基本清楚的中药、天然药物也应进行受试物样品分析。

（二）实验动物

重复给药毒性试验通常采用两种实验动物，一种为啮齿类（通常首选大鼠），另一种为非啮齿类（通常首选Beagle犬）。特殊情况可选用其他种属或品系动物。动物应对受试物敏感，来源、品系、遗传背景清楚。

实验动物应符合国家对相应等级动物的质量规定要求，具有实验动物质量合格证明。

一般选择正常、健康、性成熟动物，雌雄兼用，使用一种性别动物应给出理由，同性别体重差异应在平均体重的20%之内。

动物年龄：应根据试验期限等确定动物年龄，一般大鼠选择6～8周龄（不超过9周），Beagle犬为6～12月龄，动物年龄应尽量接近，应注明开始给药时动物年龄。

动物数量：每个剂量组动物数，啮齿类一般不少于15只/性别（主试验组10只，恢复组5只），非啮齿类一般不少于5只/性别（主试验组3只，恢复组2只）。

（三）给药方案

1. 给药剂量：重复给药毒性试验原则上至少应设低、中、高3个剂量组，以及1个溶媒（或辅料）对照组，必要时设立空白对照组和/或阳性对照组；高剂量原则上使动物产生明显的毒性反应，低剂量原则上相当或高于动物药效剂量或临床使用剂量的等效剂量，中剂量应结合毒性作用机制和特点在高剂量和低剂量之间设立，以考察毒性的剂量-反应关系。

剂量设计应考虑之前进行的各项试验所评价的终点、受试物的理化性质和生物利用度等；局部给药应保证充分的接触时间。高剂量应出现明显毒性反应，或达到最大给药量（Maximum Feasible Dose，MFD），或系统暴露量达到临床系统暴露量的100-300倍（基于AUC）。如需要在试验中途改变给药剂量，应说明剂量调整理由，完整记录剂量调整过程。

2. 给药途径：原则上应与临床拟用途径一致，如不一致则应说明理由。用于支持制定ADI的重复给药毒性试验，给药途径为经口给药。

3. 给药频率：原则上，动物应每天给药，特殊类型的受试物就其毒性特点和临床给药方案等原因，可根据具体药物的特点设计给药频率。

4. 试验期限：建议分阶段进行重复给药毒性试验，通过较短试验期限的毒性试验获得的信息，可以为较长试验期限的毒性试验设计提供给药剂量、给药频率、观察指标等方面的参考。试验期限可以根据拟定的临床疗程和用药方式等进行设计，试验期限应与所支持的给药疗程相匹配，如果存在不同疗程的多个适应证，可按最长疗程确定试验期限。具体支持关系见下表。

注：

1. 当免疫原性或耐受性问题使更长期限的试验难以进行时；拟用于危及生命的疾病（晚期肿瘤）时，非啮齿类动物可接受不超过6个月期限的试验。

2．如果用于幼龄动物，而已有药理毒理研究结果提示可能存在发育毒性，应考虑采用幼龄动物进行长期毒性试验。

3. 用于制定日允许摄入量（ADI）的经口重复给药毒性试验：是确定NOAEL的关键试验，必须包含啮齿类和非啮齿类的90天喂养试验以及一年口服慢性毒性试验，使用一种动物应给出理由。啮齿类慢性毒性和致癌性合并实施时，小鼠需要18个月或公认的转基因小鼠6个月，大鼠24个月。

（四）检测指标

重复给药毒性试验应进行的检测指标详见附表。此外，还应结合受试物的特点及其他试验中已观察到的改变或背景信息（如关于处方组成成分毒性的文献等），在不影响正常毒性观察和检测的前提下增加合理的指标。实验动物相关指标的历史数据在重复给药毒性试验中具有重要的参考意义。

在结束动物安乐死时进行一次全面检测；当试验期限较长时，应根据受试物的特点及相关信息选择合适的时间点进行阶段性检测；试验期间对濒死或死亡动物应及时采集标本进行检测，分析濒死或死亡的原因；恢复期结束时进行一次全面的检测。

给药前应对动物进行适应性饲养，啮齿类动物应不少于5天，非啮齿类动物不少于2周。在适应性饲养时，对实验动物进行外观体征、行为活动、摄食情况和体重检查，非啮齿类动物至少应进行2次体温、血液学、血液生化学和至少1次心电图检测。

给药期间，根据试验期限的长短和受试物的特点确定检测时间和检测次数。原则上应尽早发现毒性反应，并反映出观测指标或参数变化与试验期限的关系。

给药结束，对主试验组动物进行系统的大体解剖，称重主要脏器并计算脏器系数；进行组织病理学检查，首选进行对照组和高剂量组病理学检查，如果高剂量出现病变则降序检测中低剂量相应器官，应出具完整的病理学检查报告，如发现有异常变化，应附有相应的组织病理学照片。非啮齿类动物对照组和各给药组主要脏器组织均应进行组织病理学检查；啮齿类动物对照组、高剂量组、尸检异常动物应进行详细检查，如高剂量组动物某一组织发生病理改变，需要对其他剂量组动物的相同组织进行组织病理学检查；通常需要制备骨髓涂片，以便当受试物可能对动物造血系统有影响时进行骨髓检查。

给药结束后，继续观察恢复期动物，以了解毒性反应的可逆性和可能出现的迟发毒性；应根据受试物代谢动力学特点、靶器官毒性反应和恢复情况确定恢复期的长短，28天重复给药毒性试验，一般恢复期不少于2周，90天以上重复给药毒性试验，一般恢复期应不少于4周。

（五）伴随毒代动力学

重复给药毒性试验根据而需要可伴随进行伴随毒代动力学试验，具体内容参照《兽药毒代动力学研究技术指导原则》。

四、结果分析与评价

采用合适的统计学方法，对试验数据进行处理。分析重复给药毒性试验结果，判断动物是否发生毒性反应及毒性靶器官，描述毒性反应的性质和程度（包括毒性反应的起始时间、程度、变化规律和消除时间）、性别差异，如果有动物死亡应分析死亡原因，确定安全范围，并探讨可能的毒性作用机制。拟用于食品动物的兽药，其重复给药毒性得到的NOAEL值，是制定ADI时综合评估最重要的参数之一。中毒剂量小于推荐剂量2～3倍的各种原料药一般不能作为兽药使用，蓄积系数小于3的原料药一般不能长期添加使用。

（一）正确理解试验数据的意义

在对重复给药毒性试验结果进行分析时，应正确理解均值数据和个体数据的意义。啮齿类动物重复给药毒性试验中组均值的意义通常大于个体动物数据的意义，实验室历史背景数据和文献数据可以为结果的分析提供参考；非啮齿类动物单个动物的试验数据往往具有重要的毒理学意义，是试验动物数量较少、个体差异较大的原因。此外，非啮齿类动物试验结果必须与给药前数据、对照组数据和实验室历史背景数据进行多重比较，要考虑文献数据参考价值有局限性。在分析重复给药毒性试验结果时应综合考虑数据的统计学意义和生物学意义，正确利用统计学假设检验有助于确定试验结果的生物学意义，要考虑“具有统计学意义”并不一定代表“具有生物学意义”；在判断生物学意义时要考虑参数变化的剂量-反应关系、其他关联参数的改变、与历史背景数据的比较等因素；分析试验结果时，须对出现的异常数据应判断是否由受试物毒性引起并给予科学解释。

（二）正确判断毒性反应

给药组和对照组之间检测结果的差异可能来源于受试物有关的毒性、动物对药物的适应性改变或正常的生理波动，也可能源于试验操作失误和动物应激。在分析试验结果时，应关注参数变化的剂量－反应关系、组内动物的参数变化幅度和性别差异，同时综合考虑多项毒理学指标的检测结果，分析其中的关联和受试物作用机制，以正确判断药物的毒性反应。单个参数的变化往往并不足以判断化合物是否引起毒性反应，可能需要充分分析或进一步进行相关试验。此外，毒代动力学试验可以为毒性反应和毒性靶器官的判断提供重要参考依据。

（三）综合评价

重复给药毒性试验是药物非临床安全性研究的有机组成部分，是药物非临床毒理学研究中综合性最强、获得信息最多和对临床指导意义最大的一项毒理学试验，其NOAEL值也是制定ADI综合评估最重要的参数之一。对其结果进行评价时，应结合受试物的药学特点，药效学、药代动力学和其他毒理学的试验结果等进行综合评价。

重复给药毒性试验的实验动物毒性反应结果与靶动物安全试验的靶动物毒性反应可能存在差异，可能的原因为：①不同物种、种属或个体之间对某一物质的毒性反应可能存在差异，或者代谢途径及代谢产物存在差异；②重复给药毒性试验中通常采用较高的给药剂量，可能存在非线性动力学代谢过程相关的毒性反应。

五、试验报告

按照兽药GLP要求撰写试验报告。

六、附录

（一）不同情况中药的试验要求

考虑到中药各类药物处方来源、立题依据等差别，在具体进行试验时可参照以下要求进行。

1．未在国内上市销售的从中药、动物、矿物等物质中提取的有效成分及其制剂，新发现的药材及其制剂，药材新的药用部位及其制剂，未在国内上市销售的从中药、动物、矿物等物质中提取的有效部位制成的制剂，未在国内上市销售的中药注射剂。以上情况，由于其物质基础较传统中药发生了明显改变，或应用经验较少，采用啮齿类动物进行重复给药毒性试验。

2．未在国内上市销售的由中药组成的非注射给药的复方制剂，采用啮齿类动物进行重复给药毒性试验。若该类处方中含有毒性药材、无法定标准药材或有十八反、十九畏等配伍禁忌时，则应进行啮齿类和非啮齿类的重复给药毒性试验。

毒性药材：系指收入国务院《医疗用毒性药品管理办法》的中药品种。即：砒石、砒霜、水银、生马钱子、生川乌、生草乌、生白附子、生附子、生半夏、生南星、生巴豆、斑蝥、青娘虫、红娘虫、生甘遂、生狼毒、生藤黄、生千金子、生天仙子、闹羊花、雪上一枝蒿、红升丹、白降丹、蟾酥、洋金花、红粉、轻粉、雄黄。另外，凡在近年来发现的有毒性作用的药材（原材料）或在复方中含有明显有毒组分的，均按毒性药材处理。

3． 4．

5.

（二）检测指标表

注：1. 仅在非啮齿类动物称重。2. 如果眼科检查时有变化

七、参考文献

1. 农业部. 兽药30天和90天喂养试验指导原则，农业部公告第1247号，2009.

2. 农业部. 兽药慢性毒性和致癌试验指导原则，农业部公告第1247号，2009.

3. 农业部. 兽药临床前毒理学评价试验指导原则，农业部公告第1247号，2009.

4. 国家药品监督管理局药品审评中心. 药物重复给药毒性研究技术指导原则，2014.

5. VICH GL37. Studies to evaluate the safety of residues of veterinary drugs in human food: repeat-dose chronic toxicity testing，2006.

6. VICH GL31. Studies to evaluate the safety of residues of veterinary drugs in human food: repeat-dose (90 days) toxicity testing，2006.

7. OECD Guideline 408. Repeated dose 90-day oral toxicity study in rodents，2018.

8. OECD Guideline 409. Repeated Dose 90-day Oral Toxicity Study in Non-Rodents，1998.

9. OECD Guideline 452. Chronic Toxicity Studies，2018.

10. EMA. Guideline on repeated dose toxicity，2010.

来源：兽药评审中心

原文下载：兽药重复给药毒性试验技术指导原则.doc