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查看详情兽药急性毒性研究技术指导原则
一、概述
（一）定义与目的
急性毒性（Acute toxicity）是指药物在单次或24小时内多次给予后一定时间内所产生的毒性反应。急性毒性试验对初步阐明药物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意义。急性毒性试验所获得的信息对重复给药毒性试验的剂量设计和某些药物临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值，并能提供一些与动物药物过量所致急性中毒相关的信息。
（二）适用范围
本指导原则适用于兽用化学药物、兽用中药和兽用天然药物。消毒剂参考使用。
二、试验设计原则
（一）试验管理
急性毒性试验须执行《兽药非临床研究质量管理规范》或《药物非临床研究质量管理规范》。
（二）具体问题具体分析
急性毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。
对于兽用化学药物，应根据受试物的结构特点、理化性质、同类化合物情况、适应症和用药动物种群特点、试验目的等选择合适的试验方法，设计适宜的试验方案，并结合其他药理毒理研究信息对试验结果进行全面的评价。
对于兽用中药和天然药物，还应考虑到其与兽用化学药物的不同特点，试验时应根据各自不同的情况进行针对性设计。
三、基本内容
（一）受试物
化学药物：受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。应注明受试物名称、来源、批号、生产日期、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格和生产单位等，并符合试验要求。
中药、天然药物：受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品质量和安全性的样品。应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。应注明受试物的名称、来源、批号、、生产日期、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。由于中药的特殊性，建议现用现配，否则应提供数据支持配制后受试物的质量稳定性及均匀性。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格及生产单位。
在药物研发的过程中，若受试物的工艺发生变化可能影响其安全性的变化，应进行相应的安全性研究。
化学药物试验过程中应进行受试物样品分析，并提供样品分析报告。成分基本清楚的中药、天然药物也应进行受试物样品分析。
（二）实验动物
1. 种属：不同种属的动物各有其特点，对同一受试物的反应可能会有所不同。从充分暴露受试物毒性的角度考虑，采用不同种属的动物进行试验可获得较为充分的安全性信息。因此，对于兽用化学药品，急性毒性试验应采用至少两种哺乳动物进行试验，一般应选用一种啮齿类动物和一种非啮齿类动物。若未采用非啮齿类动物进行试验，应阐明其合理性。对于兽用中药、天然药物，根据具体情况，可选择啮齿类和/或非啮齿类动物进行试验[参见附录（二）]。
实验动物应符合国家对相应等级动物的质量规定要求，并具有实验动物质量合格证明。
2. 性别：通常采用两种性别的动物进行试验，雌雄各半。若采用单性别动物进行试验，应阐明其合理性。
3. 年龄：通常采用健康成年动物进行试验。如果受试物拟用于或可能用于幼龄动物，必要时应采用幼龄动物进行试验。
4. 动物数：应根据动物种属和研究目的确定所需的动物数。动物数应符合试验方法及结果分析评价的需要。
5. 体重：试验中的每批动物初始给药时的体重差异不宜过大，啮齿类动物初始给药时体重不应超过或低于平均体重的20%。
（三）给药途径
给药途径不同，受试物的吸收速度、吸收率和暴露量会有所不同。通常情况下给药途径应至少包括临床拟用途径。如不采用临床拟用途径，应说明理由。
（四）试验方法
急性毒性试验的重点在于观察动物出现的毒性反应。急性毒性急性毒性试验的试验方法较多，常用的试验方法有近似致死量法、最大给药量法、最大耐受量法、固定剂量法、上下法（序贯法）、累积剂量法（金字塔法）、半数致死量法等。应根据受试物的特点选择合适的方法，根据不同的试验方法选择合适的剂量（注释2）。
（五）给药剂量
原则上，给药剂量应包括从未见毒性反应的剂量到出现严重毒性反应的剂量，或达到最大给药量。
不同动物和给药途径下的最大给药容量可参考相关文献及根据实际情况来确定。
根据所选择的试验方法，必要时应设置空白和/或溶媒（辅料）对照组。
考虑到胃内容物会影响受试物的给药容量，而啮齿类动物禁食时间的长短会影响到受试物的肠道内吸收和药物代谢酶活性，从而影响毒性的暴露。因此，动物经口给药前一般应进行一段时间的禁食，不禁水。
（六）观察时间
给药后，一般连续观察至少14天，观察的间隔和频率应适当，以便能观察到毒性反应的出现时间及恢复时间、动物死亡时间等。如果毒性反应出现较慢或恢复较慢，应适当延长观察时间。
（七）观察指标
观察指标包括临床症状（如动物外观、行为、饮食、对刺激的反应、分泌物、排泄物等）、死亡情况（死亡时间、濒死前反应等）、体重变化（给药前、观察期结束时各称重一次，观察期间可多次称重，动物死亡或濒死时应称重）等。记录所有的死亡情况，出现的症状以及症状的起始时间、严重程度、持续时间、体重变化等。
所有的试验动物应进行大体解剖。试验过程中因濒死而安乐死的动物、死亡动物应及时进行大体解剖，其他动物在观察期结束后安乐死并进行大体解剖。当组织器官出现体积、颜色、质地等改变时，应进行组织病理学检查。
在一些情况下，为获得更为全面的急性毒性信息，可设计多个剂量组，观察更多的指标，如血液学指标、血液生化学指标、组织病理学检查等，以更好地确定毒性靶器官或剂量反应关系。
四、结果分析与评价
（一）根据所观察到的各种反应出现的时间、持续时间及严重程度等，分析各种反应在不同剂量时的发生率、严重程度。对观察结果进行归纳分析，判断每种反应的剂量－反应及时间－反应关系。
（二）判断出现的各种反应可能涉及的组织、器官或系统等。
（三）根据大体解剖中肉眼可见的病变，初步判断可能的毒性靶器官。
（四）说明所使用的计算方法和统计学方法，必要时提供所选用方法合理性的依据。
（五）根据各种反应在不同剂量下出现的时间、发生率、剂量-反应关系、不同种属动物及实验室的历史背景数据、病理学检查结果以及同类药物的特点，判断所出现的反应与药物的相关性。判断受试物引起的毒性反应性质、严重程度、可恢复性以及安全范围；根据毒性可能涉及的部位，综合大体解剖和组织病理学检查的结果，初步判断毒性靶器官。
急性毒性急性毒性试验的结果可作为后续毒理试验剂量选择的参考，也可提示一些后续毒性试验需要重点观察的指标。
五、试验报告
按照兽药GLP要求撰写试验报告。
六、术语
最大给药量（Maximal feasible dose，MFD）：指动物单次或24小时内多次（2~3次）给药所采用的最大给药剂量。
最大耐受量（Maximal tolerance dose，MTD）：是指动物能够耐受的而不引起动物死亡的最高剂量。
半数致死量（Median lethal dose，LD50）：预期引起50 %动物死亡的剂量，该值是经统计学处理所推算出的结果。
七、附录
（一）一般观察与指征
以下列出了一些常见的观察指征及其可能涉及的组织、器官和系统。急性毒性急性毒性试验中，可能需要对该表格中列出的全部或部分指征进行观察。表1仅作为结果分析评价的参考，其他科学、合理的分析均是可以接受的。
表1 一般观察与指征
观察 | 指征 | 可能涉及的组织、器官或系统 | |
Ⅰ. 鼻孔呼吸阻塞，呼吸频率和深度改变，体表颜色改变 | A | 呼吸困难：呼吸困难或费力，喘息，通常呼吸频率减慢 | |
1. 腹式呼吸：膈膜呼吸，吸气时膈膜向腹部偏移 | CNS呼吸中枢，肋间肌麻痹，胆碱能神经麻痹 | ||
2.喘息：吸气很困难，伴随有喘息声 | CNS呼吸中枢，肺水肿，呼吸道分泌物蓄积，胆碱能功能增强 | ||
B | 呼吸暂停：用力呼吸后出现短暂的呼吸停止 | CNS呼吸中枢，肺心功能不全 | |
C | 紫绀：尾部、口和足垫呈现青紫色 | 肺心功能不全，肺水肿 | |
D | 呼吸急促：呼吸快而浅 | 呼吸中枢刺激，肺心功能不全 | |
E | 鼻分泌物：红色或无色 | 肺水肿，出血 | |
Ⅱ. 运动功能：运动频率和特征的改变 | A | 自发活动、探究、梳理、运动增加或减少 | 躯体运动，CNS |
B | 嗜睡：动物嗜睡，但可被针刺唤醒而恢复正常活动 | CNS睡眠中枢 | |
C | 正位反射（翻正反射）消失：动物体处于异常体位时所产生的恢复正常体位的反射消失 | CNS，感觉，神经肌肉 | |
D | 麻痹：正位反射和疼痛反应消失 | CNS，感觉 | |
E | 僵住：保持原姿势不变 | CNS，感觉，神经肌肉，自主神经 | |
F | 共济失调：动物行走时无法控制和协调运动，但无痉挛、局部麻痹、轻瘫或僵直 | CNS，感觉，自主神经 | |
G | 异常运动: 痉挛，足尖步态，踏步，忙碌，低伏 | CNS，感觉，神经肌肉 | |
H | 俯卧：不移动，腹部贴地 | CNS，感觉，神经肌肉 | |
I | 震颤：包括四肢和全身的颤抖和震颤 | 神经肌肉，CNS | |
J | 肌束震颤：包括背部、肩部、后肢和足趾肌肉的运动 | 神经肌肉，CNS，自主神经 | |
Ⅲ. 惊厥（癫痫发作）：随意肌明显的不自主收缩或痉挛性收缩 | A | 阵挛性惊厥：肌肉收缩和松弛交替性痉挛 | CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经 |
B | 强直性惊厥：肌肉持续性收缩，后肢僵硬性伸展 | CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经 | |
C | 强直性-阵挛性惊厥：两种惊厥类型交替出现 | CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经 | |
D | 窒息性惊厥：通常是阵挛性惊厥并伴有喘息和紫绀 | CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经 | |
E | 角弓反张:背部弓起、头向背部抬起的强直性痉挛 | CNS，呼吸衰竭，神经肌肉，自主神经 | |
Ⅳ. 反射 | A | 角膜性眼睑闭合反射：接触角膜导致眼睑闭合 | 感觉，神经肌肉 |
B | 基本条件反射: 轻轻敲击耳内表面，引起外耳抽搐 | 感觉，神经肌肉 | |
C | 正位反射：翻正反射的能力 | CNS，感觉，神经肌肉 | |
D | 牵张反射：后肢被牵拉至从某一表面边缘掉下时缩回的能力 | 感觉，神经肌肉 | |
E | 对光反射：瞳孔反射；见光瞳孔收缩 | 感觉，神经肌肉，自主神经 | |
F | 惊跳反射：对外部刺激（如触摸、噪声）的反应 | 感觉，神经肌肉 | |
Ⅴ. 眼检指征 | A | 流泪：眼泪过多，泪液清澈或有色 | 自主神经 |
B | 缩瞳：无论有无光线，瞳孔缩小 | 自主神经 | |
C | 散瞳：无论有无光线，瞳孔扩大 | 自主神经 | |
D | 眼球突出：眼眶内眼球异常突出 | 自主神经 | |
E | 上睑下垂：上睑下垂，针刺后不能恢复正常 | 自主神经 | |
F | 血泪症：眼泪呈红色 | 自主神经，出血，感染 | |
G | 瞬膜松弛 | 自主神经 | |
H | 角膜浑浊，虹膜炎，结膜炎 | 眼睛刺激 | |
Ⅵ. 心血管指征 | A | 心动过缓：心率减慢 | 自主神经，肺心功能不全 |
B | 心动过速：心率加快 | 自主神经，肺心功能不全 | |
C | 血管舒张：皮肤、尾、舌、耳、足垫、结膜、阴囊发红，体热 | 自主神经、CNS、心输出量增加，环境温度高 | |
D | 血管收缩：皮肤苍白，体凉 | 自主神经、CNS、心输出量降低，环境温度低 | |
E | 心律不齐：心律异常 | CNS、自主神经、肺心功能不全，心肌梗塞 | |
Ⅶ.流涎 | A | 唾液分泌过多：口周毛发潮湿 | 自主神经 |
Ⅷ竖毛 | A | 毛囊竖毛组织收缩导致毛发蓬乱 | 自主神经 |
Ⅸ. 痛觉缺失 | A | 对痛觉刺激（如热板）反应性降低 | 感觉，CNS |
Ⅹ. 肌张力 | A | 张力低下：肌张力全身性降低 | 自主神经 |
B | 张力过高：肌张力全身性增高 | 自主神经 | |
Ⅺ. 胃肠指征 | |||
排便(粪) | A | 干硬固体，干燥，量少 | 自主神经，便秘，胃肠动力 |
B | 体液丢失，水样便 | 自主神经，腹泻，胃肠动力 | |
呕吐 | A | 呕吐或干呕 | 感觉，CNS, 自主神经（大鼠无呕吐） |
多尿 | A | 红色尿 | 肾脏损伤 |
B | 尿失禁 | 自主感觉神经 | |
Ⅻ. 皮肤 | A | 水肿：液体充盈组织所致肿胀 | 刺激性，肾功能衰竭，组织损伤，长时间静止不动 |
B | 红斑：皮肤发红 | 刺激性，炎症，过敏 |
（二）急性毒性试验常用试验方法
由于受试物的化学结构、活性成分的含量各异，毒性反应的强弱也不同，研究者应根据受试物的特点，选择以下方法或国内外公认的试验方法。
本指导原则简单介绍下列常用的试验方法，详细的实验技术细节可参考相应的文献。
1. 近似致死剂量法
该方法主要用于非啮齿类的动物试验。试验方法如下：一般采用 6只健康的Beagle犬或猴。犬的年龄一般为6-8月龄，猴的年龄一般为3-5岁，选用其他动物时应说明理由。根据小动物的毒性试验结果、受试物的化学结构和其它有关资料，估计可能引起毒性和死亡的剂量范围。按50%递增法，设计出含数个剂量的剂量序列表。根据估计，由剂量序列表中找出可能的致死剂量范围，在此范围内，每间隔一个剂量给一只动物，测出最低致死剂量和最高非致死剂量，然后用二者之间的剂量给一只动物。如果该剂量下动物未发生死亡，则该剂量与最低致死剂量之间的范围为近似致死剂量范围；如果该剂量下动物死亡，则该剂量与最高非致死剂量间的范围为近似致死剂量范围。
2. 最大给药量法
对于某些低毒的受试物可采用该方法。在合理的最大给药浓度及给药容量的前提下，以允许的最大剂量单次给药或24小时内多次给药(剂量一般不超过5g/kg体重)，观察动物出现的反应。一般使用 10-20只动物，连续观察14天。
3. 固定剂量法（Fixed-dose procedure）
该方法最初于1984年由英国毒理学会提出，不以死亡作为观察终点，而是以明显的毒性体征作为终点进行评价。
试验选择5、50、500和2000 mg/kg四个固定剂量进行试验，特殊情况下可增加5000 mg/kg剂量。实验动物首选大鼠，给药前禁食 6-12小时，给受试物后再禁食3-4小时。采用一次给药的方式进行。如无资料证明雄性动物对受药试物更敏感，首先用雌性动物进行预试。根据受试物的有关资料，从上述四个剂量中选择一个作为初始剂量；若无有关资料可作参考时，可用500 mg/kg作为初始剂量进行预试，如无毒性反应，则用2000 mg/kg进行预试，此剂量如无死亡发生即可结束预试。如初始剂量出现严重的毒性反应，即降低一个档次的剂量进行预试，如此时动物存活，就在此两个固定剂量之间选择一个中间剂量试验。每个剂量给一只动物，预试一般不超过5只动物。每个剂量试验之间至少应间隔24小时。给受试物后的观察期至少7天，如动物的毒性反应到第7天仍然存在，尚应继续观察7天。在上述预试的基础上进行正式试验。每个剂量至少用10只动物，雌雄各半。根据预试的结果，在上述四种剂量中选择一个可能产生明显毒性但又不引起死亡的剂量进行试验，如预试结果表明，5.0 mg/kg引起死亡，则降低一个剂量档次进行试验。给受试物后至少应观察2周，根据毒性反应的具体特点可适当延长。对每只动物均应仔细观察并详细记录各种毒性反应出现和消失的时间。给受试物当天至少应观察记录两次，以后可每天一次。观察记录的内容包括皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为表现等。动物死亡时间的记录要准确。给予受试物前、后各1周、动物死亡及试验结束时应称取动物的体重。所有动物包括死亡或处死的动物均应进行尸检，尸检异常的器官应作组织病理学检查。固定剂量试验法所获得的结果，参考表2标准进行评价。
表2 固定剂量法试验结果的评价
剂 量 (mg/kg) | 试 验 结 果 | ||
存活数<100% | 100%存活毒性表现明显 | 100%存活无明显中毒表现 | |
5 | 高 毒 (Very toxic) (LD50≤25mg/kg) | 有毒（Toxic） （LD50 25-200 mg/kg） | 用 50 mg/kg 试验 |
50 | 有毒或高毒，用 5mg/kg 进行试验 | 有害（Harmful） （LD50 200-2000 mg/kg） | 用 500 mg/kg试验 |
500 | 有毒或有害，用50mg/kg 试验 | LD50>2000 mg/kg | 用 2000 mg/kg 试验 |
2000 | 用500 mg/kg 试验 | 该化合物无严重急性中毒的危险性 | |
4. 上下法（序贯法，Up-and-Down Procedure，UDP）
上下法最大的特点是节省实验动物，同时，不但可以进行毒性表现的观察，还可以估算LD50及其可信限，适合于能引起动物快速死亡的药物。该方法分为限度试验和主试验。限度试验主要用于有资料提示受试物毒性可能较小的情况。可以从与受试物相关的化合物或相似的混合物或产品中获得相关毒性资料。在相关毒性资料很少或没有时，或预期受试物有毒性时，应进行主试验。
限度试验：是最多用5只动物进行的序列试验。试验剂量为2000 mg/kg，特殊情况下也可使用 5000 mg/kg。
2000 mg/kg剂量水平的限度试验: 将受试物给予1只动物。如果该动物死亡，则进行主试验；如果该动物存活，依次将受试物给予另外4只动物，动物总数为5只。如果1只动物在试验后期死亡，而其他动物存活，应停止对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡。后期死亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价: 有3只或3只以上动物死亡时，LD50小于2000 mg/kg；有3只或3只以上动物存活时，LD50大于 2000 mg/kg；如果有3只动物死亡，则进行主试验。
5000 mg/kg剂量水平的限度试验: 特殊情况下，可考虑使用 5000 mg/kg的剂量。将受试物给予1只动物。如果该动物死亡，则进行主试验；如果该动物存活，将受试物给予另外2只动物。如果这2只动物都存活，则LD50大于 5000 mg/kg，停止试验（即不再对其他动物给药，观察14天）。如果这2只动物中有1只死亡或者2只均死亡，将受试物给予另外2只动物，一次1只。如果1只动物在试验后期死亡，而其他动物存活，应停止对其他动物给药，对所有动物进行观察，是否在相似的观察期间也发生死亡。后期死亡的动物应与其他死亡的动物同样计数，对结果进行如下评价。有3只或3只以上动物死亡时，LD50小于5000 mg/kg；有3只或3只以上动物存活时，LD50大于5000 mg/kg。
主试验: 由一个设定的给药程序组成，在此程序中，每次给药 1 只动物，间隔至少48小时。给药间隔取决于毒性出现时间、持续时间和毒性的严重 程度。在确信前一只动物给药后能存活之前，应推迟按下一剂量给药。时间间隔可以适当调整，但使用单一时间间隔时，试验会更简便。第一只动物的给药剂量低于LD50的最接近的估计值。如果该动物存活，第二只动物给予高一级剂量；如果第一只动物死亡或出现濒死状态，第二只动物给予低一级剂量。剂量级数因子应选定为 1/（剂量-反应曲线斜率估计值）的反对数（对应于斜率2的级数因子为3.2），并应在整个试验过程中保持不变。当没有受试物的斜率的有关资料时，使用3.2为剂量级数因子。使用默认级数因子时，剂量应从以下序列中选择：1.75、5.5、17.5、55、175、550、2000 mg/kg（或有特殊要求时 1.75、5.5、17.5、55、175、550、1750、5000 mg/kg）。如果没有受试物的致死估计值，应该从175 mg/kg开始。如果预期动物对该受试物的耐受程度变化很大（即，估计斜率小于 2.0），那么开始试验前应考虑增加剂量级数因子超过按对数剂量计算的默认值 0.5（即，级数因子为3.2）。同样，对于已知斜率很陡的受试物，应选择小于默认值的级数因子。在决定是否及如何对下一只动物给药之前，每只动物都应认真观察达48小时。当满足停止试验标准之一时，停止给药，同时根据终止时所有动物的状态计算LD50估计值和可信区间。用最大可能性法计算LD50值（经验证的计算软件）。当满足下列停止试验标准之一时，停止试验：（a）连续3只动物存活；（b）任意连续6只试验动物中有5只连续发生存活/死亡转换；（c）第一只动物发生转换之后至少有4只动物进入试验，并且其LD50估算值的范围超出临界值（2.5 倍）。（首次转换的第4只动物之后，对每次给药进行计算）。
对于LD50和斜率的各种组合，在动物发生死亡/存活转换之后，用4~6只动物即可满足停止试验标准（C）。但在一些情况下，化合物的剂量-反应曲线的斜率较小，可能另外还需要增加动物（总共可达 15 只）。
5. 累积剂量设计法（金字塔法，Pyramiding dosage design）
在非啮齿类动物进行急性毒性试验可采用此方法。经典的试验设计需要8只动物，分对照组和给药组，每组4只动物，雌雄各2只。 剂量的设计可以是1、3、10、30、100、300、1000、3000 mg/kg，也可 以采用10、20、40、80、160、320、640、1280 mg/kg，通常隔日给予下一个高剂量，剂量逐渐加大，直到出现动物死亡时或达到剂量上限时为止。当没有动物死亡时，MLD（最小致死剂量）和LD50大于最高剂量或受限制剂量。当在某一剂量所有动物均出现死亡时，MLD和LD50应在最后两个剂量之间。当在某一剂量部分动物出现死亡，部分死亡出现在后继的下一个高剂量，此时，MLD位于首次出现死亡的剂量和前一低剂量之间，LD50则应在首次出现动物死亡的剂量和所有动物均死亡的剂量之间。假如没有动物死亡发生，常常以最高剂量给予动物5-7天，以确定后续的重复给药试验中高剂量的选择。
6. 半数致死量法
是一种经典的急性毒性试验方法，试验结果经统计学处理可获得受试物的LD50。
八、参考文献
1.CDE.药物单次给药毒性研究技术指导原则.2014
2.CDE.化学药物急性毒性试验技术指导原则.2005
3.OECD TG425.Acute Oral Toxicity: Up-and-Down Procedure.2022
4.OECD TG420.Acute Oral Toxicity – Fixed Dose Procedure.2001
来源：兽药评审中心
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